生殖器疱疹诊断及鉴别诊断

　　HSV感染的诊断要依据病史、临床表现和实验室检查结果而定。有不洁性交史，而且在生殖器部位出现皮肤红斑和原发性水疱，易复发等不难诊断。必要时可作疱液涂片，培养、接种、免疫荧光检查。血清免疫抗体测定等，均有助于诊断和确定病毒类型。
　　
　　一、细胞学方法
　　
　　对皮损刮片做Wright-Gemsa（Tzanck试验）或Papanicolaou染色，可检出HSV感染特征的巨细胞包函体，但不能区别HSV感染或水痘—带状疱疹病毒感染，敏感性仅为病毒分离的60%。
　　
　　二、培养法
　　
　　从水疱底部取材做组织培养分离病毒，为目前较敏感、最特异的检查方法，需5-10天，因其技术条件要求高，价格昂贵，不能普遍使用。三、抗体检测
　　
　　目前最广泛的是HSV-2抗体检测，如蛋白印迹法也可用gD2作抗原检测HSV-2抗体，具有敏感性，且能区分HSV-1和HSV-2的优点。
　　
　　四、基因诊断
　　
　　（一）用PCR分型检测单纯疱疹病毒
　　
　　PCR是一种敏感性高，特异性强的快速检测方法，标本中含有1fgHSV-DNA就可以检出，其在HSV感染的诊断研究中发展较快，且分型检测HSV是发展的趋势。
　　
　　1、标本采集和处理
　　
　　（1）标本采集
　　
　　①脑脊液：直接无菌采取患者0.5ml脑脊液标本于无菌试管送检.如肉眼可见血色,应离心取上清。
　　
　　②羊水及婴儿血清:同上,应避免溶血.
　　
　　③脑组织:脑组织尸检、活检标本,加1mlPBS标本缓冲液研磨后，待检。
　　
　　④眼及皮肤病灶分泌物：用预测（半干）棉拭子直接取患处分泌物，置1mlPBS标本缓冲液中送检。
　　
　　⑤生殖器（宫颈、阴道、外阴、阴茎）标本：先用消毒棉拭子擦去病变部位表面粘液、污垢，再用预潮棉拭子用力擦拭患处分泌物，置1mlPBS标本缓冲液中送检。
　　
　　（2）标本处理
　　
　　①预处理：所有液体标本均可直接进行模板制备；可以取100μl标本液，离心5000r/min×5min后，去上清，取沉淀物进行模板制备。
　　
　　②模板制备：a:蛋白酶K消化裂解法：沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液，55℃1h后，煮沸10min，离心5000r/min×5min，收集上清。b:水煮法：沉淀物加100μl蒸馏水，摇均水煮20min，离心5000r/min×5min收集上清。c:1%TritonX-100裂解法:取采集的标本液100μl，加入1μlTritonX-100，水煮20min，5000r/min×5min，收集上清。d:5%NP-40裂解法：取采集的标本液100μl，加5μlNP-40，水煮20min，5000r/min×5min收集上清。e:如标本溶血严重经上述裂解处理后，再加等体积酚-氯仿抽提、冷乙醇沉淀DNA，加10μlDW溶解待检。
　　
　　2、PCR扩增
　　
　　（1）引物设计。以HSVDNA聚合酶的高保守区为检测靶序列以确保特异性。设计3个引物，一个上游共同性引物，DNAP5（5′ATGGTGAAAACATCGACATGTACGG3′）：二个下游特异性引物，DNAP3-1（5′CCTCGCGTTCGTCCTCGTCCTCC3′　）和DNAP3-2（5′CCTCCTTGTCGAGGCCCCGAAAC3′），可以分别扩增出HSV-1469bpDNA片段（1981～2359）、HSV-2391bp片段（1561～1953）：从二型PCR扩增产物中设计了一个不分型的特异性探针HSVP35‘GGCGTAGTAGGCGGGGATGTCGCG3‘）。
　　
　　（2）PCR实验体系。取模板10μl：DNAP50.5（0.2μmol/L）：DNAP3-10.5μl(0.2μmol/L)：DNAP3-20.5μl(0.2μmol/L)：4×dNTP8μl(4×200μmol/L)：10×dNTP8μl(4×200μmol/L)；10×缓冲液10μl：DMSO4μl；加DW65.5μl；石蜡油30μl.。
　　
　　水煮（96℃～100℃）7min
　　
　　加TaqDNA聚合酶1μl；（2.5U）
　　
　　72℃4min
　　
　　↓
　　
　　95℃40s
　　
　　↓
　　
　　65℃60snbsp;→nbsp;72℃70s
　　
　　↓　　33个循环
　　
　　70℃4min
　　
　　3．扩增产物的检测和分析
　　
　　（1）琼脂糖凝胶电泳染色法：取扩增产物20μl加样品缓冲液4μl混匀后，点样于2%琼脂糖凝胶板，70V电泳15～20min，溴化乙锭（EB）染色5min，于紫外灯下观察结果在溴酚蓝后面有一条或二条亮红带为阳性结果，HSV-2带在前，HSV-1带在后，无带则为阴性结果。
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